Peter Parker (Tobey Maguire) wreszcie zdobywa dziewczynę swoich marzeń, Mary Jane Watson (Kirsten Dunst), a Nowy Jork ogarnia Spider-mania! Kiedy jednak nowy symbiont sprawia, że kostium Spider-Mana staje się czarny, jego najmroczniejsze demony wychodzą na światło dzienne, zmieniając Spider-Mana zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz. Spider-Man musi stoczyć walkę swojego życia ze śmiertelnie niebezpieczną armią złoczyńców - zabójczym Sandmanem (Thomas Haden Church), Venomem (Topher Grace) i Nowym Goblinem (James Franco) - a także ze swoim wewnętrznym wrogiem.